Tipi di fluorescenza microscopi

Quando microscopi sono stati inventati intorno al 1600 dC, filosofi naturali girato gli occhi su un mondo all'interno di un mondo . Quando Antony van Leeuwenhoek realizzato piccoli , lenti altamente curve e un supporto meccanico per la regolazione del punto di vista, ha aperto una finestra sul mondo microscopico dei batteri , cellule del sangue, protozoi e la struttura cellulare delle piante. Ma tutta la storia della microscopia , c'è sempre stata una domanda: Cosa sono queste strane cose viste attraverso una lente ? Microscopia a fluorescenza si riferisce ad un insieme di tecniche che minimizza tale incertezza - perché in microscopia a fluorescenza quando la luce è brillato su un campione , brilla di luce propria destra indietro . Epifluorescenza
epifluorescenza microscopi brillare e raccolgono la luce attraverso le stesse ottiche .

Di gran lunga il microscopio a fluorescenza più comune è la configurazione epifluorescenza . In un microscopio a epifluorescenza , una sorgente luminosa - tipicamente una lampada al mercurio o xenon - brilla attraverso un filtro che seleziona una regione ristretta di lunghezze d'onda . La luce filtrata brilla sul campione attraverso la lente obiettivo microscopio . La luce incidente è assorbita da fluorofori - etichette molecolari che emettono luce di una lunghezza d'onda quando assorbono luce di una lunghezza d'onda più corta . Luce da fluorofori , insieme a luce diffusa dalla sorgente di illuminazione , ritorna nella lente obiettivo e al rilevatore o occhio . Lungo la strada , un altro filtro blocca la luce di illuminazione , così tutto ciò che rimane è la luce fluorescente dal campione .
Confocale

un microscopio a epifluorescenza raccoglie la luce da ovunque all'interno del campo visivo del microscopio . Una parte della luce di eccitazione viene assorbita prima del piano focale del microscopio , alcuni al piano focale e alcuni oltre il piano focale . Poiché il microscopio raccoglie tutta quella luce , l'immagine conterrà un'immagine nitida di luce alla messa a fuoco , ma avrà anche la luce out-of -focus da altre regioni . Un microscopio confocale fissa che puntando un punto laser nello stesso piano come il microscopio viene focalizzata . Poi , un foro passa davanti al rivelatore , dove blocca tutta la luce che non proviene dal fuoco microscopio . Con la scansione del campione, un ambiente pulito un'immagine tridimensionale dell'oggetto può essere ottenuto .
Multiphoton
In un microscopio a fluorescenza la luce proviene da molecole all'interno del campione .

In un microscopio confocale l'allineamento è molto sensibile . Se il punto laser , l'obiettivo del microscopio , l'ottica di raccolta e il foro stenopeico sono fuori anche la minima quantità delle prestazioni microscopio soffre. Un microscopio multiphoton aggira questo problema utilizzando una lunghezza d'onda del laser che è solo la metà di energico come deve essere per eccitare i fluorofori nel campione . L'unico modo fluorofori si eccitano ed emettono fluorescenza è se la luce laser è abbastanza luminoso in modo che due particelle di luce - fotoni - colpiscono il fluoroforo in un tempo molto breve . Questo accade solo quando il laser viene focalizzato in un punto molto piccolo . Quindi l'unico posto nel campione che emettono luce è dove il laser viene focalizzato , che mantiene l'immagine bella e pulita perché non c'è nessuno sfondo luce supplementare per sbarazzarsi di - . Che non significa pinhole per allineare
fluorescenza Reflection
totale interno ( TIRF )
Un campione singolo può avere più fluorofori .

Un altro modo per ottenere immagini molto pulite è quello di assicurarsi che la luce di eccitazione non ottiene molto lontano nel campione . Se un grumo di neuroni , per esempio , è collocato in una goccia di soluzione su un vetrino , poi alcuni dei neuroni aderirà alla superficie del vetro . In un totale fluorescenza di riflessione interna ( TIRF ) microscopio a luce è diretta lateralmente nel vetrino in modo che in realtà non fanno nella soluzione che tiene le cellule . Ma una parte della luce Perdite appena nella soluzione - solo molto vicino alla superficie del vetro . Questo significa che gli unici luoghi che emettono luce sarà in una regione molto sottile proprio contro la superficie del vetro . Per qualcosa come i neuroni , dove tanta roba interessante accade sulla superficie delle cellule , questa tecnica può essere molto efficace
Super - Resolution

Tutti i microscopi . - compresi microscopi a fluorescenza - sono limitati dalla fisica che governa la propagazione della luce . Una delle regole fondamentali è che una macchia di luce concentrato può ottenere solo così piccolo - e non più piccola . Per la luce visibile , che la dimensione è di circa 200 nanometri , o 200 miliardesimi di metro . Ma le singole molecole sono solo pochi nanometri , quindi ci sono un sacco di caratteristiche interessanti che sono sotto di tale limite di dimensione , chiamate il limite di diffrazione . Gli scienziati stanno sviluppando tecniche di " super- risoluzione " di nascosto intorno a quel limite. Microscopia illuminazione strutturata ( SIM) e stimolata esaurimento delle emissioni ( STED ) microscopia, per esempio , sono entrambi metodi di microscopia a fluorescenza che limitano la dimensione dello spot light-emitting , riducendo la dimensione del punto luce di eccitazione .